Nature 618권, 169~179페이지(2023)이 기사 인용
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표적 점유는 특히 RNA의 경우 생물학적 활성을 유도하기에는 불충분한 경우가 많으며, 이는 소분자에 의한 RNA 구조의 분자 인식을 둘러싼 오랜 과제로 인해 더욱 복잡해졌습니다. 여기에서 우리는 천연물에서 영감을 받은 소분자 수집과 3차원적으로 접힌 RNA 구조 사이의 분자 인식 패턴을 연구했습니다. 인간 전사체 정의 구조-활동 관계 전반에 걸쳐 이러한 상호 작용 환경을 매핑합니다. 기능성 부위에 결합하는 RNA 결합 화합물은 생물학적 반응을 유도할 것으로 예상되었지만, 대부분의 확인된 상호작용은 다른 곳에 결합하기 때문에 생물학적으로 불활성인 것으로 예측되었습니다. 우리는 그러한 경우에 RNA 생물학을 조절하는 대체 전략은 리보뉴클레아제 표적화 키메라를 통해 표적을 절단하는 것이라고 추론했습니다. 여기서 RNA 결합 분자는 RNase L1에 결합하고 국소적으로 활성화하는 헤테로사이클에 추가됩니다. RNase L에 대한 기질 특이성과 소분자의 결합 환경의 중첩은 분해제로 전환될 때 생체 활성을 가질 수 있는 많은 유리한 후보 결합제를 나타냅니다. 우리는 질병 관련 microRNA-155(pre-miR-155), JUN mRNA 및 MYC mRNA의 전구체에 대한 선택적 분해기를 설계하는 개념 증명을 제공합니다. 따라서, 소분자 RNA 표적 분해를 활용하여 강력하지만 비활성인 결합 상호작용을 강력하고 특정한 RNA 기능 조절자로 전환할 수 있습니다.
건강 및 질병 생물학에서 RNA의 중요성은 잘 문서화되어 있으며2, 화학 생물학 내에서 각각 기능을 연구하거나 기능 장애에 개입할 수 있는 기회를 제공합니다. RNA의 서열 기반 표적화는 종종 표적을 절단하기 위해 리보뉴클레아제에 결합한 다음 모집하는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행됩니다3. 분자 인식은 염기쌍4을 통해 발생하므로 이 양식은 RNA의 구조화되지 않은 영역을 표적으로 삼는 데 가장 적합합니다. 그러나 RNA는 고도로 구조화될 수 있으며 생물학적 기능은 구조에 따라 결정되는 경우가 많습니다5,6. 특히, 이러한 구조화된 영역은 RNA 접힘에 의해 제시된 포켓과 상호 작용하는 작은 분자의 결합에 의한 표적화가 가능합니다. 그러나 소분자만으로는 RNA 구조를 점유하는 것만으로는 생물학적 효과를 이끌어내기에 충분하지 않은 경우가 많습니다8.
여기에서 우리는 생물학적으로 비활성인 RNA 결합 소분자를 강력하고 특정한 기능의 이펙터로 변환하는 전략을 개발했습니다. 이는 RNA 분자 인식 요소를 리보뉴클레아제에 결합하고 활성화하여 표적을 절단하는 두 번째 화합물에 부착함으로써 달성됩니다. 우리의 초점은 세 가지입니다: (1) 작은 분자와 RNA 접힘 사이의 결합 상호 작용을 정의합니다. (2) 프로그래밍 가능한 방식으로 생물학적으로 불활성인 매우 선택적인 결합 상호 작용을 표적 분해 유도제로 전환하여 강력하고 선택적인 기능적 억제제를 제공합니다. (3) 작은 분자가 RNA를 제거할 수 있는 패러다임을 확립합니다.
다양한 특성9을 지닌 15,000개 구성원의 천연물과 유사한 소분자 화합물 컬렉션을 3 x 3 내부 루프 라이브러리에 제시된 RNA 3D 접힘 라이브러리에 대한 결합에 대해 조사했습니다(ILL; 61,440,000개의 잠재적인 결합 상호 작용 조사)(그림 1a ). 3 × 3 ILL의 4,096개의 고유한 RNA 접힘에는 1 × 1, 2 × 2 및 3 × 3 내부 루프뿐만 아니라 벌지 루프 및 완전히 쌍을 이루는 RNA가 포함됩니다. RNA에 결합하는 라이브러리의 화합물이 염료를 대체하고 방출을 감소시키는 형광 염료 치환 분석을 사용하여 결합을 평가했습니다. 15,000개의 소분자(10μM)에 대한 1차 분류를 통해 1,584개의 히트 화합물이 생성되었습니다(확장 데이터 그림 1a). 상위 480개 화합물에 대한 2차 검증을 통해 344개의 결합 소분자가 생성되었습니다. 이러한 다양한 화합물에는 1-benzylidene-1-indene 및 phenothiazine과 같은 6개의 RNA 결합 지지체가 포함됩니다(그림 1b).
8. Preference for 3 × 3 internal loops and one-nucleotide bulges was collectively observed for these compounds. Of these 1,044 motifs, only 23 (2.2%) are present in highly expressed human transcripts (n = 2,712 total motifs), and 375 are new motifs with no previously known small-molecule binder. Inforna contains over 100,000 RNA–small molecule interactions and 6,453 unique RNA motifs of various types. d, Although around 6% of all miRNAs can be bound by C1–C6, only about 30% of targetable sites within them are functional (Drosha or Dicer processing site) and are therefore predicted to induce a biological effect. The other approximately 70% are unproductive interactions that are predicted to be biologically silent. We identified that 48% of miRNAs that have ligandable non-functional sites are potential substrates for RNase L, which could be targeted by RIBOTACs. Thus, biologically inert binders can be converted into bioactive RIBOTACs that provoke targeted degradation. Statistical significance referred to in c was calculated using two-tailed Student's t-tests./p> 8—a statistical threshold considered to be bound by the small molecule13—were analysed (n = 329 unique motifs; Fig. 1c). Notably, these compounds collectively showed a preference for 3 × 3 internal loops (78.4% bound by small molecules versus 48.3% in the initial library; P < 0.001) and one-nucleotide bulges (5.2% compared to 2.1%; P < 0.001; Fig. 1c). Among the 329 unique motifs, 258 had no known small-molecule binder. LOGO analysis of the RNAs in the top 0.5% of statistically significant enriched loops (Zobs > 8) revealed that each molecule binds to a unique RNA sequence pattern (Extended Data Fig. 2)./p> 8, among which 117 are new with no previously known small-molecule binders (Extended Data Figs. 4 and 5 and Supplementary Table 1). Combining these with motifs bound by C1–C6, this study contributes 375 new RNA motifs to the current database of RNA–small-molecule interactions. An analysis of the RNAs selected by the azolium salts revealed that the top three small molecules predicted to bind to the 5′GAU/3′C_A motif in pre-miR-155 were C19, C1 and C20, in rank order. Affinity measurements showed that only C1 and C20 bind to the A bulge of miR-155, while C19 binding was undetermined due to aggregation under assay conditions (Extended Data Fig. 3d). As observed for C1, C20 showed no saturable binding to an RNA with the A bulge changed to an AU pair (Extended Data Fig. 3d)./p> 1), with 1 upregulated and 28 downregulated. Notably, these 29 transcripts were also affected to a comparable extent by LNA-155 treatment (Extended Data Fig. 7i). When considering downstream targets of miR-155 predicted by TargetScanHuman (v.7.0)35 (n = 469), 307 (65%) were upregulated by pre-miR-155-RIBOTAC. A similar percentage (68%) of these 469 targets was also upregulated by LNA-155. Notably, 263 targets were upregulated by both pre-miR-155-RIBOTAC and LNA-155. A comparison of the normalized read counts for all genes between pre-miR-155-RIBOTAC and LNA-155 treatment showed a highly significant correlation, with R > 0.99 (Extended Data Fig. 7i). Collectively, these data indicate that pre-miR-155-RIBOTAC affects the transcriptome in similar ways to an oligonucleotide targeting miR-155 (LNA-155) and with limited off-target effects, although additional studies are needed to assess the selectivity of miRNA knockdown. Notably, pre-miR-155-RiboTAC selectively reduced miR-155 levels miRnome-wide in MDA-MB-231 cells forced to express wild-type pre-miR-155 but not those forced to express a binding site mutant (Extended Data Fig. 8a)./p> 50 µM) (Extended Data Fig. 10a). These data were corroborated by an orthogonal binding assay using Cy-5-labelled RNAs (Extended Data Fig. 10b). Target engagement was validated both in vitro and in the pancreatic cancer cell line MIA PaCa-2 (Extended Data Fig. 10c,d) using Chem-CLIP and its competitive variant. Finally, although in vitro binding assays and target validation confirmed engagement of the JUN IRES with JUN-binder, this molecule was biologically inert, with no effects on JUN mRNA or protein levels up to concentrations of 2 µM (Fig. 4c and Extended Data Fig. 10e)./p> 
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